分类学是区分有机体的种类并将之分类的理论和实践；系统学(Systematics)是关于生物分类、生物多样性以及生物间亲缘关系的研究。Charles(1970)进一步厘清系统学和生物分类学的关系为：系统学的领域包括(a)提供生物的科学名称，(b)描述生物，(c)保存被命名和描述的生物的标本，(d)确定生物分类地位、分类检索特征和分布数据，(e)研究生物的进化史，(f)考虑生物的环境适应：两个学科历史悠久但近年来混淆不清的主要原因是所涵盖的内容；(e)和(f)与进化有关，其他则属于分类问题；考虑上述(a)一(d)因素，生物分类学属于系统生物学的一部分。Mayr认为，由于生物物种数量庞大，虽然形态分类只是以少数可分辨的成对性状为基础，但分类学仍然是整个系统学的主干和基础；早期分类主要强调检索表的制作，现在分类着重于为信息贮存和信息检索系统构建索引。全球分类学倡议(GTI)则规定，根据广义的理解，生物分类是指生物类别的划分，但这门学科通常侧重的是对物种、物种的遗传变异性以及物种之间的关系进行描述；就生物多样性公约实践应用来说，对生物分类的理解是最广义的，其中包括遗传、物种和生态系统层面上的系统学和生物系统学。[1]
分类学的概念一直在发展中，由于生物演化是无法完全模拟的已发生事实，因而系统发育学方法有多种手段来分析、评估和推测生物间的亲缘关系，分类学概念因此多年来难以统一。即使是广义的分类法，不同学术领域的理解和定义也不一致。GenBank应用了‘'NCBI Taxonomy'’一词，试图以林奈物种系统来对分子数据进行归类，然而Taxonomy的用词严谨性遭到非议；生物信息学(Bioinformatics)一词原本包括基因、物种和生态系三个不同层次的所有生物数据，但此概念一度成为研究基因数据库的代名词，Costcllo等对这种认识上的偏颇进行了校正，从基因、物种、种群三个层面上厘清了生物信息学和生态信息学(Ecoinformatics)、亲缘信息学(Phyloinformatics)、物种信息学(SpeciesInformatics)、生态信息学(Ecoinformatics)以及地理信息学之间的关系。[2]而对鱼类种群的鉴别运用到生物信息学，这也就把分子生物学技术运用到了水产上。
台湾大学渔业科学研究所蔡怀祯教授等, 应用生物技术不仅能让鱼变性, 还能在饲料中添加含鱼类生长蛋白质基因的酵母, 加快鱼的生长。还可用精子为媒介, 将外来的生长蛋白质基因转殖到卵内, 培育出一种快速生长的改良种。前一种方法只能让1 代鱼长的快, 而后一方法则是基因改良, 而且可以世代繁殖的新品系。目前, 他们已研制成功的有转基因泥鳅与九孔, 成功率超过50 %。基因转殖处理的泥鳅比不处理的泥鳅在6 个月内的生长速度要快2.5 倍到4 倍, 特别是九孔, 已开发出成长快2 倍的新品系。他们用生长蛋白质基因加速生长成功的鱼类有吴郭鱼(南洋卿)、乌鱼、黄鳍细和黑纲。此种鱼类食用安全, 口感有待评估。
分子生物学技术在水产养殖病原体检测中的应用
目前, 我国水产养殖业尤其是虾类、贝类和鱼类养殖业受到病原微生物的严重影响, 因此如何快速准确预报和诊断水产动植物疾病, 就成为当前水产养殖业十分重要而突出的问题。进些年来, 分子生物学技术的迅速发展, 已经有可能为水产养殖病原体的检测提供快速有效而且特异性强灵敏度高的技术手段。
单克隆抗体技术
单克隆抗体技术是Kohler 和Milstein[3]于1975 年发展起来的利用杂交瘤细胞制备大量针对某一抗原决定簇的特异性抗体的技术。单克隆抗体与常规血清抗体相比, 特异性强, 能识别单一抗原决定簇, 且容易制备, 能通过保持细胞系重复获得相同抗体, 因而在水产养殖病原体检测中得到广泛应用。如应用于诊断海湾扇贝( Argopecten irradians )的鳃立克次体、诊断与鱼类及牡蛎相结合的淋巴细胞病毒、检测菲律宾蛤仔棕环病病因弧菌P1。另外, 近年来已有人利用此技术制备了抗鳗弧菌的单克隆抗体和抗嗜水单胞菌外毒素的单克隆抗体。据陈琼等1996 年报道, 利用该技术制备的单克隆抗体可用于提纯嗜水气单胞菌hec 毒素。
酶联免疫吸附检测
酶联免疫吸附检测( ELISA) [4]是将抗原或抗体吸附在固相载体表面, 使抗原抗体反应在固相载体表面进行的一种检测技术。该技术将抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用有机地结合起来, 通过酶作用于底物后呈现的颜色变化来显示抗原抗体特异反应的存在, 因此特异性强, 灵敏度高, 反应快速, 结果可以定量, 也可对抗原、抗体以及抗原抗体复合物进行定位分析。目前ELISA 法在水产养殖病原体诊断尤其在鱼病学诊断上应用较广。国内如钱冬等1993 年用该法检测细菌性败血症病原) ) ) 嗜水气单胞菌, 陈怀青等。1993 年应用Do-t ELISA 法检测鱼类致病性嗜水气单胞菌hec 毒素, 黄等1995 年利用单克隆抗体酶联免疫技术检测对虾皮下造血组织坏死病病毒, 李焕荣等1997 年应用Do-t ELISA 法快速检测嗜水气单胞菌的致病因子胞外蛋白酶Ah ECPase54, 均取得较为满意的效果。国外则较早用ELISA 法对疖疮病、红嘴病、细菌性肾脏病和爱德华氏菌病等鱼类疾病进行快速诊断。另外, Noel [5]等利用该法鉴定导致菲律宾蛤仔患棕环病的弧菌P1。
核酸杂交技术
核酸杂交技术是利用特定标记的DNA 或RNA 探针和病原体生物中的与探针互补的靶核苷酸序列进行杂交, 以此来确定宿主是否携带有病原体的一类分子生物学技术, 可分为Southern 杂交Northern 杂交和核酸原位杂交[6]。该技术以其灵敏度高、特异性强和检验快速等优点, 近年来在对虾病毒等水产养殖病原体检测中倍受青睐。如Futo等、Hiney等1992 年将此技术用来诊断细菌性鱼病, Comps等1996 年应用地高辛标记的RNA 探针检测FEV 病毒在海洋鱼类中的表达, Bruce 等1994 年利用地高辛标记的DNA 探针检测对虾杆状病毒。日本也有人利用地高辛标记的DNA探针进行菌落杂交用于鳗弧菌的鉴定; 利用经PCR合成的探针与神经坏死病病毒DNA 进行杂交选择亲鱼, 可有效防止病毒性神经坏死症( VNN) 的垂直感染。我国的研究人员针对1993 年以来导致我国养殖对虾大规模死亡的病原)) ) 皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV) 已研制出相应的核酸探针, 用于检测受该病毒感染的对虾。
PCR 技术
PCR 技术聚合酶链式反应( PCR) 是体外酶促合成迅速扩增特异DNA 片段的一种方法。这项分子生物学技术产生虽仅数年, 却以惊人的速度广泛地应用于分子生物学各个领域。目前PCR 技术已用于水产养殖病原体检测的实际操作, 如Chang[7]等1993年利用PCR 技术首次成功地进行对虾病毒的扩增, Wang 等1996 年用PCR 方法检测对虾杆状病毒, 并获得了预计的扩增产物。另外, 也有人应用PCR 技术检测贝类肠道病毒以及水或水生生物体内富集的病毒和细菌。除应用于病原体检测外, PCR 技术还与其他分子生物学技术联用, 广泛应用于水产养殖业其他诸多领域。如应用于鱼类生长激素基因、各种cDNA 分子的克隆; 应用于检测外源基因是否整合入转基因鱼基因组中; 应用于制作多基因家族基因组探针以及鱼类种群结构的遗传分析和种质遗传鉴定等。
用分子生物学技术分类有以下几种方法。
1. 1 免疫学方法 由于免疫学的发展, 人们又用免疫学方法进行分类。但是, 这种方法具体操作烦琐, 随之被人们抛弃。
1. 2 同工酶电泳技术 这种技术可以定量估计种群和种间的遗传变异程度。日本的Nakabo等利用该技术对东南亚海区鲈鱼进行分析, 推翻了东亚地区只有一种鲈鱼的说法。李思法等研究了鲂属团头鲂、三角鲂及广东鲂种间遗传关系及种内遗传差异, 确定了各个亚种之间的进化关系[ 8]。
1. 3 鱼类DNA 指纹图谱技术 它具有多位点,高变异和简单的遗传方式等特点。它在鱼类系统进化和亲缘关系鉴定方面被广泛应用, 特别是线粒体DNA ( mtDNA) 技术。mtDNA 具有种群内稳定性高, 分子量小, 演化速度快, 种间差异大, 母子遗传等特点。一般用于物种、种群的遗传物质鉴定, 研究物种的进化关系和种群的鉴定。Avise等以mtDNA 用限制性长度多态性( RFLP) 技术分析了美洲鳗和欧洲鳗的产卵场, 否定了过去一直认为它们具有混合产卵场的说法; 江世贵等 用mtDNA 扩增出细胞色素b( cytb) 基因, 对4 种鲷科鱼类进行了分类和系统进化研究, 得出了与传统形态学分类不一样的结论[9]。
1. 4 随机扩增DNA 多态性( RAPD) 分析技术RAPD 技术被广泛应用于群体遗传学、遗传育种学及生物系统分类与进化研究等方面。Dinesh等[ 5] 用RAPD 方法分析12 种鱼的DNA 序列, 发现每一种鱼RAPD 扩增产物的电泳图谱都不一样, 即有种的特异性。赵凯等用RAPD 技术对青海湖浮裸鲤、鲫鱼、草鱼进行研究后认为, 该技术适用于科的分类, 而亚种间的变异水平较高, 进行相似性分析比较困难。陈自明等用RAPD技术对特化等级裂腹鱼类亲缘关系进行研究, 认为对属级及属级以上分类单元适用, 但对一些遗传差异较大的类群( 如裂腹鱼) 会出现个体之间遗传距离接近或达到100% 的情况, 不能用RAPD技术。李学英等应用RAPD 技术对南方鲶和普通河鲶建立了RAPD 分子遗传学标记。
1. 5 短串联重复多态性分析技术( STR 技术) 主要用于鱼的种群关系和进化关系研究。Beashman等对红大马哈鱼进行了研究, 认为用STR能够区分不同地区的红大马哈鱼种群。Harris等用STR 对淡水龙虾进行了研究, 能够区分不同地区的品种。Rex roadI II 等对鳕科鱼类进行了研究, Landry 等对大西洋鲑进行了研究, 得到相同结果。
运用Hae Ⅲ/33.6、HaeⅢ/33.15、Hinf Ⅰ/33.6、Hinf Ⅰ/33.15 4种限制酶/探针组合对奥利亚罗非鱼、美国尼罗罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼三种群体罗非鱼进行非放射性DNA指纹图谱研究，结果表明在三种罗非鱼群体中4种限制酶/探针组合都能产生具有种属特异性和个体特异性的DNA指纹图谱.Hae Ⅲ/33.6、HaeⅢ/33.15组合中奥利亚罗非鱼特有的强阳性杂交图带可作为鉴别奥利亚罗非鱼的分子遗传标记.4种限制酶/探针组合在奥利亚罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼、美国尼罗罗非鱼检出的个体平均图带数分别为8.726、8.086和6.975.4种限制酶/探针组合在奥利亚罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼、美国尼罗罗非鱼检出的多态性位点比例分别为62.95%、96.31%和85.26%.
DNA指纹图谱的鉴别能力
运用4种酶/探针组合对3种群体罗非鱼的研究表明，奥利亚罗非鱼的指纹图谱明显地区别于尼罗罗非鱼的指纹图谱.说明DNA指纹图谱具有种特异性，可以用来区分不同的种.用Hae Ⅲ/33.6、HaeⅢ/33.15组合对三种群体罗非鱼研究时，奥利亚罗非鱼群体呈现1条杂交信号极强的种群内每个个体共享的图带，而这是尼罗罗非鱼所没有的，因此，这一图带完全可以作为鉴别奥利亚罗非鱼的分子遗传标记.
参考文献
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［4］李志忠.奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼同工酶的研究［D］.［硕士论文］南京农业大学图书馆：南京农业大学，1997.
［5］王文君.奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼线粒体DNA遗传差异的研究［D］.［硕士论文］南京农业大学图书馆：南京农业大学，1996.
［6］王天奇.随机多态性DNA法分析奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因组多态性的研究［D］.［硕士论文］南京农业大学图书馆：南京农业大学，1997.
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