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你必须知道的质谱鉴定中10条FAQ

  • 发布日期:2016/8/25 17:27:11 阅读次数:1698
  •        质谱技术在蛋白鉴定等实验中具有不可忽视的作用,应用前景十分广泛。那么,有问题了怎么解决呢?

      问题1. 一级质谱和二级质谱有什么区别?什么时候做一级,什么时候做二级?

      答:一级质谱鉴定的方式主要指胎指纹图谱(peptide-mass mapping, PMF),即利用质谱仪精确测量酶解片段的分子量并搜库比较实现蛋白质的鉴定,二级质谱是在一级质谱的基础上再选择部分肽段做进一步的破碎并对碎片进行深入分析和比较,鉴定出该肽段的序列并结合PMF的结果从而实现蛋白质的鉴定。二级质谱能够得到部分肽短的序列,具有更高的可靠性。随着现在杂志对数据的要求越来越严格,二级质谱鉴定是蛋白鉴定的大趋势,而且即使目前做一级质谱鉴定的结果,也需要挑选部分PMF结果做二级质谱验证。

      问题2. 研究的物种不是模式生物怎么办?

      答:可以参考亲缘关系最近的模式生物做比对而实现蛋白质的成功鉴定,如果质谱图很好而没有鉴定结果说明这是一个全新的蛋白,可以采用de-novo等技术做深入分析与鉴定。

      问题3. 该如何评价质谱效果的好坏?

      答:做PMF一般得分超过60分(P<0.05)就算成功鉴定,而串联质谱,得分超过60分或者虽然没有超过60分,但是有最少一条肽段的得分超过30分就算成功鉴定。

      问题4. 一些特殊的质谱方法有什么用途?

      答:质谱的其它用途包括修饰位点分析、蛋白测序、混合蛋白鉴定以及分子量精确测定、二硫键位置分析等等。

      问题5. 用什么染色方法比较好?

      答:最好用考马斯亮蓝法进行染色,银染也可以,但鉴定成功率稍低,并且推荐用串联质谱对银染蛋白进行鉴定可以大大提高鉴定成功率。

      问题6 质谱鉴定取胶点有什么注意事项?

      答:离心管最好用进口离心管,以免塑料污染;水最好用去离子水或者双蒸水;取点的时候带好口罩与手套,以免角蛋白污染。

      问题7. 凝胶是否可以长期保存?该如何保存?如何运送?

      答:蛋白凝胶可以长期保存而不影响质谱鉴定效果,一般而言,如果在一两个星期以内,最好用保鲜膜包好,放到4度冰箱保存,如果保存时间超过一个月,可以把蛋白点取下后放入-20度或者-80度冰箱,不会影响后续质谱鉴定效果。运送胶点的时候采用常温运送即可,三五天内都不会有太大的影响。

       问题8. 质谱鉴定大致是什么流程?

      质谱鉴定主要包括蛋白酶解、质谱数据获取、对库检索三个步骤。

      问题9. 串联质谱鉴定和质谱测序有什么区别?

      质谱鉴定往往采用软件对已有数据库进行自动检索匹配得到结果,而质谱测序则需要根据质谱峰图中相邻或者相近峰的分子量差异直接推算出肽段的序列。

      问题10. 未知蛋白质是通过质谱还是蛋白质测序仪来测序的呢?

      现在比较简单的方法是质谱法。如果质谱法不能确定的话还可以结合N端测序,可测10几个氨基酸。两个数据结合分析基本可以确定目的蛋白了,现在的蛋白质组数据库相当强大了。

    注:华南标准物质网-国家标准物质采购平台

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