一、纤维素酶的作用机制
纤维素酶对纤维素的降解是一个多底物、多酶催化、多相的极为复杂的过程。一般首先要吸附到纤维素上,该过程与酶本身的性质和底物的特性有关,其能力大小与酶的含糖量和疏水性有关联,而吸附过程是否可逆需视具体酶的种类而定,例如里氏木霉的CBHU和EGUl对纤维素的吸附是可逆的,而CBHl则是不可逆的。
然而,由于纤维素酶及纤维素底物的多样性和高度复杂性导致了纤维素降解过程机理研究的困难,因此,到目前为止,纤维素酶使纤维素水解成为葡萄糖过程中的具体细节仍没有完全研究清楚。目前关于纤维素降解机理的研究存在多种假说,结论尚未完全统一,但普遍认为纤维素的生物降解过程涉及到一组复合的纤维素酶,必须依靠功能不同但又互补的三种纤维素酶组分的协同作用才能完成。至于各组分的作用方式,作用顺序和部位,以及协同作用的分子学机理等方面,许多学者扔持有不同的看法,但对于各组分问存有很强的协同作用及部分单一组分酶的水解效果这两方面有一定的共识。
Reese等曾阐明没有一种纤维素酶产生菌能产生出分解棉花中的天然纤维素的酶,但发现有的菌株产生的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素,因而在1950年对纤维素酶的作用方式提出了著名的C1-Cx假说,该假说认为由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解,并得到大多数人的支持。该假说如下所示。
结晶纤维素→(C1)→无定形纤雏素→(Cx)→可溶性产物→(葡萄糖苷酶)→可溶性产物
其理论要点是:当纤维素酶作用纤维素时,CI酶首先作用于结晶纤维素,使形成结晶结构的纤维素链开裂,长链分子的末端部分分离,从纤维素的非还原多聚体末端水解纤维二糖,将天然纤维素分解为直链纤维素,使其转变成可被Cx酶作用的水合非结晶形式,从而使纤维素链易于水解,继而由Cx酶随机水解非结晶纤维素,即可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的内在β-1,4-糖苷键将直链纤维素内部切断,分解为纤维二糖和纤维寡糖,再由β葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。但该理论对Cl酶作用机制的解释并不清楚,且CI酶和Cx酶分阶段水解纤维素的理论在以后的实验中没得到证实。若先用C1酶作用结晶纤维素,然后将Cl酶与底物分开再加入Cx酶,如此顺序作用并不能将结晶纤维素水解,只有当CI、Cx以及β-葡萄糖苷酶同时存在才能水解天然纤维素。
目前最容易被大多数学者所普遍接受的酶水解机理是协同理论。Wood在研究木霉和青霉的纤维素酶水解纤维素时,发现培养液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同作用;Faterstam发现两种外切酶(CBH I和CBH II)具有协同作用:Kanda等还发现了只是对可溶性纤维素进攻方式不同的两种内切葡聚糖酶在结晶纤维素的水解过程中具有协同作用。协同理论一般认为:纤维素的生物降解是由EG、CBH和BG三个组分共同作用的结果,且各种酶组分之间的比例需要协调。一般来说,协同作用与酶解底物的结晶度成正比,当三种酶组分的活性比例与霉菌发酵滤液中各组分比相近时,协同作用最大,活性最高,且不同菌源的内切与外切酶之问也具有协同作用。
二、纤维素酶的应用
纤维素酶是一种作为生物催化剂的复合酶,尤其是微生物纤维素酶,在纺织、食品、酿酒、造纸、饲料、医药等多个领域应用广泛,市场需求量较大。
1.纤维素酶在纺织工业中的应用
纺织业是我国纤维素酶需求量最大的行业之一。利用纤维素酶对纤维织物进行酶降解的生物整理和表面改性,主要包括生物打磨(biostoning)和生物抛光(biopolishing),以改善纤维织物的外观及质量,是我国近年来从国外引进的新工艺,被认为是生物工程技术与纺织工程技术的完美结合,其酶用量一般为0.5~3%。它作为一种高效、无污染、低能耗的新工艺,己经取得了突破性进展,显示出了极大的优越性,在国外已进入实用阶段,并有大量专利发表。
纤维素酶可以增大纤维素的非结晶区,增强其柔软度,使表面伸出的小纤维末端被除去,使纤维织物表面剥离和纵向复合细胞间层侵蚀,使纤维梢丝束化或脱落.因此,使织物表面变得光滑。纹理清晰,色泽明亮,蓬松,悬垂性好,吸湿性强,手感厚实柔软,染料能均匀渗透,花纹精细。着色力大大提高,另外还可获得水洗或石磨的效果,有效地提高了纤维织物的服用性能及产品的档次。在牛仔布加工过程中,用酶水洗比浮石处理损伤要小,且不要额外的柔软剂,有利于保护环境,使加工服装的质量优良。
2.纤维素酶在食品工业中的应用
纤维素酶在食品工业中的应用极为广泛。日常食用的农副产品通常是植物细胞的内含物,如蛋白质、淀粉、油脂及糖等,而纤维素是细胞壁的主要成分,因此,恰当地利用纤维素酶处理,能使细胞壁软化、膨胀,进而改变细胞壁的通透性,便于细胞内含物的释放及提取,简化食品的加工工艺,提高食品的营养价值和消化率。纤维素酶用于淀粉制造,可缩短时间,增加得率;用于大豆处理,可促进其蜕皮,增加从大豆和豆饼中提取优质水溶性蛋白质和油脂的得率;用于胡萝卜混汁制取,可制得色泽鲜艳、混浊稳定性好、无不良胡萝卜本味、具有一定营养价值的胡萝卜混汁:用于柑桔果汁加工,可促进汁液的提取和澄清:用于速溶茶制备,可提高得率,保持茶叶的色、香、味和营养成分;用于海藻粉前处理,可提高海藻脂质的抽提率,同时降低生产成本:用于酱油酿造,能分解包裹蛋白质的纤维素,使蛋白质裸露,便于被蛋白酶分解,可以提高氨基酸及还原糖的含量,提高酱油得率,加速发酵,改善酱油质量和风味;用于保鲜蔬菜加工,可加速脱水等;用于面制品制备,可提高其烘焙品质、质地及营养品质,延长其货架寿命;用于柑橘皮渣制取全果饮料,可将一半以上的粗纤维降解为膳食纤维,后者具有很高的医疗保健价值。
3.纤维素酶在酿酒工业中的应用
由于纤维素酶能分解植物原料中的部分纤维素,主要产物葡萄糖能被酵母利用,破坏植物细胞壁能有利于淀粉的释放和利用,所以将纤维素酶用于果酒、米酒、白酒、啤酒及葡萄酒等制造,可以同时将淀粉和纤维素转化为糖,再经酶母分解全部转化为酒精,发酵过滤性好,溶液黏度低,缩短酿造周期,提高出酒率和原料利用率,而且酒的口感醇香,质量纯正,杂醇油含量低。另外,纤维素酶和酿酒酵母可同时使用,进行同步糖化和发酵,此工艺的糖化速度比单行糖化快。其中,啤酒酿造包括大麦的发芽以及随后麦芽汁的制备和发酵,纤维素酶可水解β-1,3-和β-1,4-聚糖,增加麦粒溶解性,加快大麦发芽,减少糖化液中单一葡萄糖含量,改进过滤性能,利于酒精蒸馏;而葡萄酒则需要从葡萄里抽提出葡萄汁并且用酵母使葡萄汁进行发酵,能显著提高出洒率,增加葡萄酒的香味,且酒体质量纯正。当前,重组型酵母产生的β-1,3和β-l,4-葡聚糖酶已被广泛地应用在酿造工业中。
4.纤维素酶在造纸工业中的应用
几年来,纤维索酶的研究和应用在一定程度上解决了造纸工业而临的原料短缺、能源紧张和污染严重等问题,作为一种特殊的催化剂,纤维索酶在造纸工业生产过程中已有不少实际应用,如废纸脱墨、纤维索的酶改性、酶促打浆、改善纸张性能、树脂障碍控制、漂白、以及废水处理等。酶法脱墨是一种新型的脱墨工艺,比常规碱法脱墨优势明显。纤维素酶可以改变纤维表面或油墨离子附近的连接键,从而使油墨分离,经洗涤或浮选法脱除,提高脱墨效率,能降低能耗、减轻环境污染,且可以通过改变酶的组成、用量、处理时间、pH值和添加一些助剂来控制油墨粒子的大小分布和形状,从而有效地去除大粒径的、扁平的和刚硬的油墨,其脱墨浆游离度高、滤水性能好、物理性能优、白度高和残余油墨量低,能改善非接触印刷废纸的脱墨性能。采用纤维素酶处理可以降低机械的磨浆能耗,提高化学浆的打浆性能,改善纸浆纤维性质,缩短打浆时间,节省设备和动力,并可实现打浆的连续化。采用纤维素酶适当处理纸浆,能增加微细纤维的生成量,提高保水度,提高成纸的抗张指数、提高薄页纸的柔软性,改善纤维压缩性,提高密度,能有效节约精炼过程中的能耗,提高手感硬度。
5.纤维素酶在饲料工业中的应用
近年来,纤维素酶在饲料工业中的应用越来越普及。纤维素酶作为一种饲料添加剂,是饲料用复合酶的主要成分之一,在国外商业化应用己较成熟,国内虽起步不久,但以每年10-20%的速度发展。将纤维素酶加入饲料中,可以提高饲料的档次和利用率。由于畜禽饲料中含有大量的纤维素,除某些反刍动物具有分解纤维素能力外,大部分畜禽不具备此能力。纤维素酶可以摧毁植物细胞壁,补充动物内源酶的不足,将粗饲料(如麦秸、麦糠、稻草、玉米芯等)中的一部分纤维素转化为可被非反刍动物利用的糖。消除抗营养因子,增大肠道内容物的流动性,使营养物质更好地被吸收利用,改善动物胃中微生态环境,促进动物健康生长等,此外还能减少畜禽排泄物中氮、磷的排泄量,保持水体和土壤免受污染,因而是一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料。
目前国内外利用纤维素酶主要有体外酶解法和体内酵解法两种。体外酶解法是把纤维素酶和粗料混匀,在一定温度、湿度和pH条件下堆积和密封发酵一定时间,晾干后直接饲喂动物:体内酵解法是把纤维素酶以添加剂的形式加到精料中,拌匀后饲喂动物,借助于动物消化道的内环境发挥作用。在实际应用中,纤维素酶通常与其他酶(如半纤维素酶、果腔酶、争葡聚糖酶等)共同作用,提高动物对饲料营养物质的分解和消化。
6.纤维素酶在医药工业中的应用
中草药大部分是植物药,其所含成分十分复杂,既有有效成分,又有无效成分和有毒成分。有效成分主要存在于细胞壁内的酶或液泡中,为了提高中草药的治疗效果,就要尽最大限度提取有效成分,去除无效成分及有毒成分,但由于细胞壁的存在阻碍了这些有效成分的释出,其提取一直制约我国医药产业的发展,因此必需采取适当的提取工艺,使细胞壁破碎,从而使有效成分释放出来。常用的提取方法(如煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等)虽然能够去除无效成分和有毒成分,保留有效成分,但工序较多,周期较长,有效成分损失较大,且高温会破坏生药结构,低温不利于纤维素的破坏。而采用纤维素酶处理可以在常温常压下迅速有效地破坏植物细胞壁的致密结构,有利于有效成分的提取。该方法既符合传统的中医理论,又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的,能取代高温、高压、水浸、酸碱处理等传统工艺,降低设备投资,节约能源,利于环保,经济效益显著。王瑞红等利用纤维素酶解工艺提取金银花绿原酸,结果显著提高了金银花提取物得率和绿原酸得率,最大可使绿原酸得率提高54.20%。马桔云等在黄连提取工艺中发现,纤维素酶酶解工艺比不酶解工艺提取的黄连有效成分高出许多(p<O.01)。杨军宣等用纤维素酶提取三七总皂甙,结果提取率提高了23.5%。但也有用纤维素酶提取中成药成分不成功的例子,如韩颂等用纤维素酶法提取的甘草酸得率比不用纤维素酶低,原因可能是纤维素酶被部分甘草酸水解。因此,要进一步拓宽纤维素酶在中草药提取方面的应用领域。还需要进一步深入探讨有效成分的化学结构、酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂等对药物提取的影响。此外,纤维素酶可作为消化剂与其他酶配合使用,制备帮助人体消化吸收纤维素的药品,帮助肠胃消化,消除涨气。
7.纤维素酶在其他领域中的应用
纤维素酶应用于发酵工业,将自然界和工农业生产中的废纤维(如木屑、废纸),经适当的前处理(如酸水解或碱水解),再经纤维素酶水解后产生的葡萄糖用来生产酒精,可以开辟新能源和解决环境污染等问题;应用于单细胞蛋白生产,既可减少环境污染,又可得到食用蛋白和动物蛋白;应用于遗传学研究,特别足植物体细胞的杂交育种,能在温和的条件下消化破碎植物细胞壁,释放原生质体,使植物和真茼原生质体的制备变得简便,产量商,且能保持其新鲜的正常结构和活力:应用于家庭洗涤剂,特别足碱性纤维素酶,其内切葡萄糖苷酶主要与棉纤维中仅占lO%左右非结晶区纤维素分子起作用,可选择性吸附在棉纤维非结晶区,使棉纤维膨松,水合纤维素分解,胶状污垢脱落。增加去污能力,从织物表面除去小的碎纤维,增加织物农而的亮度和光泽;应用于地质钻井,作为破胶剂比化学破胶液安全可靠:此外,还广泛应用于农业生产、清洁剂配制、化工印染、化妆品生产、城市垃圾处理、粪便处理、废水处理及其他研究开发等方面。
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