在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与反应，生成环己醇亚硝酸酯，与磺胺重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色染料，在550nm波长测其吸光度，与标准比较定量。
1．仪器
①分光光度计。
②漩涡混合器。
③离心机。
④透析纸。
2．试剂
①三氯甲烷。
②甲醇。
③透析剂：称取0．5g二氯化汞和12．5g氯化钠于烧杯中，以0．01mol·L-1HCl溶液定溶至100mL。
④10g·L-1亚硝酸钠溶液。
⑤10％硫酸溶液。
⑥100g·L-1尿素溶液(临用时新配或冰箱保存)。
⑦10％盐酸溶液。
⑧10g·L-1磺胺溶液。
⑨1g·L-1盐酸萘乙二胺溶液。
⑩环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取0．1000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解，最后定溶至100mL，此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠1：mg(临用时将环己基氨基磺酸钠标准溶液稀释10倍，此液每毫升含环己基氨基磺酸钠0．1mg)。
3．样品处理
①液体样品：摇匀后直接称取。含二氧化碳的样品先加热除去，含酒精的样品用40g／L的氢氧化钠调至碱性，于沸水中加热除去，制成试样。称取10g已制备好的试样于透析纸中，加10mL透析剂，将透析纸口扎紧，放人盛有80mL水的200mL广口瓶中，加盖，透析20～24h得透析液。定量转人1．0mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
②固体样品：凉果、蜜饯类样品将其剪碎制成试样，准确称取2g已剪碎的试样于研钵中，加少许层析硅胶研磨成干粉状，经漏斗倒入100mL容量瓶中，加水冲洗研钵，并将洗液一并转移至容量瓶中加水至刻度，不时摇动，lh后过滤，即得试样。准确吸取10．00mL经处理后的试样提取液于透析纸中，加l0mL透析剂，将透析纸口扎紧，放人盛有80mL水的200mL广口瓶中，加盖，透析20～24h得透析液。定量转人100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
4．标准曲线的绘制及样品中甜蜜素的测定
分别准确吸取0．00，2．50，5．00，7．50，10．00，12．50，15．00mL甜蜜素标准液及10．00mL透析液于8个50mL具塞比色管中，于0～3℃冰水浴中，加1mL，(10g·L-1)亚硝酸钠溶液，1mol(10％)的硫酸溶液，混匀，于冰水浴中不时摇动，放置1h，取出后加15mL水，振动1min，静置后取上层液，分别准确加入5mL三氯甲烷于各比色管中，各加入15mL甲醇，1mL(10g·L-1)磺胺，置冰浴中15min，取出，待回到常温后，各加入1mL(1g·L-1)盐酸萘乙二胺溶液，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在15～30℃下放置15～30min，用1cm比色皿，在波长为550nm处测吸光度。从标准曲线中即可查得甜蜜素的含量。
5．计算
X=m1/[m*(V1/V2)]
式中：x——样品中甜蜜素的含量，g·kg-1、mg·g-1；
m1——从标准曲线上查得甜蜜素的含量，mg；
m——称取样品的质量，g；
V1——测定时所用样品的体积，mL；
V2——样品的总体积，mL。
