食品中合成色素利用聚酰胺在酸性条件下,与水溶性酸性染料能牢固的结合,而在碱性条件下又能将色素解吸,然后用薄层色谱法进行分离鉴别后,与标准比较定量,或用分光光度计测吸光度定量。
1.仪器
①研钵(玻璃或瓷)。
②G2、G3耐酸漏斗。
③抽滤瓶(500mL、1000mL)。
④白瓷蒸发皿(50mL、10ml。)。
⑤微量注射器(50µL、l0µL)。
⑥玻璃基板(3cm×15cm、8cm×15cm、16cm×20cm)
⑦层析缸(11cm×10cm×18cm)。
⑧粉粒收集器(自制)。
⑨涂敷器。
⑩电吹风。
⑩分光光度计。
2.试剂
⑴聚酰胺粉,80~100目,100℃活化1h。
⑵硅胶G。
⑶甲醇-甲酸溶液(6:4)。
⑷甲醇溶液(99.5%)。
⑸丙酮一氨溶液:40mL丙酮、5mL水及1mL浓氨水混合,用时现配。
⑹20%的柠檬酸溶液。
⑺硫酸溶液(10%)。
⑻10%的磷钨酸或钨酸钠溶液。
⑼乙醇一氨溶液(9:1)。
⑽氢氧化钠5%。
⑾石油醚(沸程90~120℃)。
⑿甲醇一醋酸溶液(1:1)。
⒀冰醋酸。
⒁海沙(过20目筛,经酸碱处理和漂洗干净,烘干备用)。
⒂淀粉酶溶液:取淀粉酶2g,溶于10mL水中,用滤纸过滤后得澄清溶液,贮存于冰箱中备用。
⒃可溶性淀粉。
⒄展开剂
a.正丁醇:无水乙醇:1%氨溶液(6:2:3)。
b.正丁醇:吡啶:1%氨水(6:3:4)。
c.异丁醇:无水乙醇:水(6:2:2)。
d.正丁醇:吡啶:5%氨水(6:6:4)。
e.2.5%柠檬酸钠:浓氨水(4:3)。
f.甲醇:乙二胺:浓氨水(10:3:4)。
g.2.5%柠檬酸钠:10%氨水(4:3)。
h.醋酸乙酯:吡啶:水:浓氨水(35:15:5:7)。
i.甲醇:浓氨水:乙醇:(5:l:10)。
⒅标准溶液(0.1mg·mL-1):胭脂红、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、日落黄、亮蓝、新红、赤藓红等。准确称取上述色素各0.1000g,用pH6的蒸馏水溶解,移人100mL容量瓶中,并稀释刻度,混匀。临用时精确吸取该溶液5mL(根据所测项目),置于50mL容量瓶中,加pH6的蒸馏水稀释至刻度,混匀。浓标准溶液需在暗处保存。
3.样品处理
①非酒精饮料:准确吸取样品50mL于100mL烧杯中,汽水需加热驱除二氧化碳。
②配制酒:准确吸取样品100mL于烧杯中,加碎瓷片或玻璃珠,然后加热除酒精。
③水果糖:准确称取粉碎混匀样品10g,加水30mL温热溶解,若样品液pH值较高,用20%柠檬酸溶液调至pH为4左右。
④含淀粉制品(如淀粉软糖等):准确称取切碎混匀样品10g,加水50mL。加热溶解,用20%柠檬酸溶液调至pH5,于88~90℃,加淀粉酶溶液5mL,搅匀后保温5~10min,溶液澄清后取出。
⑤含蛋奶制品(如奶糖、蛋糕、冰淇淋等):准确称取破碎混匀样品10g,加海砂少许,用热风吹干,加入石油醚30mL搅拌,放置片刻,倾出石油醚,如此重复处理三次,以除去脂肪,吹干后研细,全部转入G3耐酸漏斗中,缓慢抽滤,用乙醇_氨水溶液提取色素至色素溶液全部提尽,立即用l:10硫酸调溶液至微酸性,再多加lmL,加10%磷钨酸溶液1~2mL,置水浴上浓缩至约20mL,使蛋白质沉淀,用G3耐酸漏斗慢慢抽滤,用少量水洗涤,收集洗滤液。
⑥蜜饯类(如山楂片等):准确称取研碎样品1.5g~2g,加水30mL,加热使之溶解。
⑦肉制品:将肉用不锈钢剪刀剪成小颗粒,置于研钵中捣碎,混匀,准确称取样品lg左右,加3g海砂、20mL丙酮于研钵中一起研磨,以除脂肪和水,重复用丙酮处理三次,用滴管吸出或倾出每次的丙酮的抽提液。将残留物研成细粉,去残留溶剂,将粉末全部转移到G。耐酸漏斗中,用甲醇或乙醇的氢氧化钠溶液从肉蛋白质中提取色素物质,用玻璃棒搅动漏斗中内容物,直至色素全部提取完为止。将色素溶液加热至70℃,用10%硫酸调到pH为1,加10%磷钨酸lmL,慢慢搅动,使蛋白质凝聚沉淀.将此沉淀物移入G3耐酸漏斗中抽滤,用10mL70℃蒸馏水洗涤漏斗,吸集全部滤液。
4.吸附分离
称取聚酰胺粉0.5~1g于小烧杯中,加少量水调成糊状,水浴上加热至70℃的处理后的样品液中,充分搅拌,使色素完全被吸附,如聚酰胺粉不足可补加。将聚酰胺沉淀物全部移入G3耐酸漏斗中,抽滤,用20%柠檬酸酸化至pH为4的70℃水反复洗涤。每次约20mL,边洗边搅拌,若含天然色素,再用甲醇一甲酸溶液洗涤1~3次,每次约20mL,至洗液无色为止。用70℃水再多次洗涤至洗液与原水pH相同为止。洗涤过程中必须充分搅拌,再用乙醇一氨溶液,分次解吸全部色素,收集全部解吸液,用20%柠檬酸溶液调节至pH为6。(若用分光光度法测定,则用pH为6的蒸馏水定容至50mL;若用薄层色谱测定则将原液置水浴上浓缩至约2mL后移人5mL容量瓶中,用50%乙醇洗涤容器,洗液并人容量瓶中并稀择至刻度)